CRISPR被认为是研究和发现药物的强大的工具,可以在不引入外来DNA的情况下,以高度定向的方式改变任何细胞中的任何基因。CRISPR/Cas9相对于以前的基因编辑形式,如TALENs和锌指核酸酶(ZFN)的优点是,它更容易操作,并且在执行双等位基因修改方面具有更高的效率。
必威体育app手机版提供基于GenCRISPR™的基因编辑服务,可以使用任何哺乳动物细胞系,针对任何基因生产基因编辑的细胞。
服务类型 | 服务详情 | 细胞系选项* | 交付内容** | 交付周期 |
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定制化knock-in细胞系服务 |
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120+种常见适合转染的细胞系,包括A549, CHO-K1, HEK293, HEK293T, HT-29, MDA-MB-231, 4T1, A20, HCT116, MCF7, MDCK, U937, RPMI 8866等 |
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14~24周 |
EZ knock-out细胞系服务 |
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120+种常见适合转染的细胞系,包括A549, CHO-K1, HEK293, HEK293T, HT-29, MDA-MB-231, 4T1, A20, HCT116, MCF7, MDCK, U937, RPMI 8866等 |
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10-19周 |
定制化knock-out细胞系服务 |
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任何癌细胞系 |
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16-24周 |
Knock-out细胞池服务 |
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任何细胞系 |
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5-11周 |
*一般由客户提供细胞系,如果必威体育app手机版提供细胞系,则需额外收费。且必威体育app手机版不提供原代细胞、干细胞或IPS细胞的基因编辑服务。
**根据要求在mRNA或蛋白水平验证全等位基因修饰细胞系。
可选服务
附加服务 | 详情 |
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逆转录PCR(RT-PCR) | 通过RT-PCR进行测序,验证敲除克隆在CDS上插入缺失标记的mRNA水平。 |
Western blot | 通过WB验证敲除克隆,必须在宿主细胞中提供与靶蛋白(RNAi或敲除)特异性结合的有效抗体。 |
FACS分析 | 通过FACS验证敲除克隆,必须在宿主细胞中提供与靶蛋白(RNAi或敲除)特异性结合的有效抗体。 |
启动子活性分析 | 宿主细胞中启动子(Cbh/CMV/EFS)的活性分析最大化gRNA-Cas9的切割效率。 |
转染方法优化 | 难转染细胞转染方法的分析最大化gRNA-Cas9的切割效率。 |
脱靶分析 | 通过对前5个潜在的脱靶位点进行测序来确定基因敲除克隆 |
附加单克隆 | 从同一个细胞库中挑选出另外一个单克隆发给客户。 |
案例分析1
- 在4号外显子中通过插入缺失,敲除人类结肠癌细胞HCT116中的K-ras位点,如图1所示。
- 对Cas9和gRNA递送颗粒进行慢病毒包装,HCT116细胞进行病毒滴度优化。对每个单克隆进行Sanger测序,选择K-ras基因在第4号外显子上敲除的纯合子,如图2所示。
- 通过Western Blot方法验证所选克隆中K-ras基因表达缺失,如图3所示。

图1:K-ras敲除方法

图2:亲代细胞和K-ras-/- HCT116细胞sanger测序

图3:K-ras敲除蛋白表达验证
案例分析2
- 设计并合成gRNA,以靶向GS等位基因上的特定区域。用该载体转染DG44细胞,并通过Sanger测序分析细胞池。
- 获得了几个单克隆并进行Sanger序列分析。一个单克隆包含移码突变(图1)。
- 分析GS敲除克隆的GS蛋白表达(图2)。
- 为了评估功能丧失,在有或没有谷氨酰胺浓度增加的情况下培养GS敲除克隆(图3)。在没有谷氨酰胺的情况下GS敲除克隆不能生长。在增加谷氨酰胺时GS敲除克隆生长,因此确定GS敲除细胞系的功能缺失。
- 总之,成功靶向GS产生的单克隆已完全验证GS功能的缺失。

图1:GS等位基因缺失引起移码突变

图2:在GS敲除细胞裂解液中,anti-GS抗体未检测到谷氨酰胺合成酶

图3:DG44(GS-/-)的L-谷氨酰胺依赖性
案例分析3
- 设计一对gRNA靶定基因组上的基因进行全基因缺失。使用GenCRISPR™技术优化gRNA对,对Jurkat细胞的切割效率最大(图1)。
- 配对的gRNAs共转染到Jurkat细胞中,并通过FACS分选富集。通过PCR评估缺失效率,根据条带灰度计算,转染细胞池占21%(图2)。
- 采用高通量PCR方法筛选到了200个单克隆,并通过Sanger测序和RT-PCR验证全等位基因缺失克隆(图3)。

图1

图2:PCR验证gRNA对

图3:缺失克隆筛选
相关服务
- 必威体育app手机版还提供 GenCRISPR™ gRNA质粒构建服务,您只需提供靶向基因序列,即可为您精心设计gRNA序列(此项免费),合成并克隆至您指定的任何载体中。
- 必威体育app手机版提供 CellPower™过表达稳定细胞系构建服务,帮助您开发外源表达目的基因的稳定细胞系。
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