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GenCRISPR™ 细胞系服务

CRISPR被认为是研究和发现药物的强大的工具，可以在不引入外来DNA的情况下，以高度定向的方式改变任何细胞中的任何基因。CRISPR/Cas9相对于以前的基因编辑形式，如TALENs和锌指核酸酶(ZFN)的优点是，它更容易操作，并且在执行双等位基因修改方面具有更高的效率。

必威体育app手机版提供基于GenCRISPR™的基因编辑服务，可以使用任何哺乳动物细胞系，针对任何基因生产基因编辑的细胞。

服务内容

服务类型	服务详情	细胞系选项*	交付内容**	交付周期
定制化knock-in细胞系服务	在任意基因组位置插入或修饰基因脂质体转染或电转客户指定的目的基因/区域和细胞*	120+种常见适合转染的细胞系，包括A549, CHO-K1, HEK293, HEK293T, HT-29, MDA-MB-231, 4T1, A20, HCT116, MCF7, MDCK, U937, RPMI 8866等	一个全等位基因敲除细胞系一个未修饰细胞（或亲代细胞）测序验证两周一次的项目更新	14~24周
EZ knock-out细胞系服务	单基因knock-out 细胞系脂质体转染或电转客户指定的目的基因/区域和细胞*	120+种常见适合转染的细胞系，包括A549, CHO-K1, HEK293, HEK293T, HT-29, MDA-MB-231, 4T1, A20, HCT116, MCF7, MDCK, U937, RPMI 8866等	通过测序验证的两个全等位基因敲除细胞系一个阴性敲除细胞系作为对照两周一次的项目更新	10-19周
定制化knock-out细胞系服务	单基因或多基因knock-out细胞系脂质体转染/慢病毒转染/电转客户指定的目的基因/区域和细胞	任何癌细胞系	测序验证1-2个全等位基因敲除细胞系一个阴性敲除细胞系作为对照两周一次的项目更新	16-24周
Knock-out细胞池服务	单基因knock-out稳定细胞系慢病毒转染客户指定的目的基因/区域和细胞*	任何细胞系	经过序列验证的包含knock-out克隆的稳定细胞池两周一次的项目更新	5-11周

*一般由客户提供细胞系，如果必威体育app手机版提供细胞系，则需额外收费。且必威体育app手机版不提供原代细胞、干细胞或IPS细胞的基因编辑服务。

**根据要求在mRNA或蛋白水平验证全等位基因修饰细胞系。

附加服务	详情
逆转录PCR（RT-PCR）	通过RT-PCR进行测序，验证敲除克隆在CDS上插入缺失标记的mRNA水平。
Western blot	通过WB验证敲除克隆，必须在宿主细胞中提供与靶蛋白（RNAi或敲除）特异性结合的有效抗体。
FACS分析	通过FACS验证敲除克隆，必须在宿主细胞中提供与靶蛋白（RNAi或敲除）特异性结合的有效抗体。
启动子活性分析	宿主细胞中启动子（Cbh/CMV/EFS）的活性分析最大化gRNA-Cas9的切割效率。
转染方法优化	难转染细胞转染方法的分析最大化gRNA-Cas9的切割效率。
脱靶分析	通过对前5个潜在的脱靶位点进行测序来确定基因敲除克隆
附加单克隆	从同一个细胞库中挑选出另外一个单克隆发给客户。

在4号外显子中通过插入缺失，敲除人类结肠癌细胞HCT116中的K-ras位点，如图1所示。
对Cas9和gRNA递送颗粒进行慢病毒包装，HCT116细胞进行病毒滴度优化。对每个单克隆进行Sanger测序，选择K-ras基因在第4号外显子上敲除的纯合子，如图2所示。
通过Western Blot方法验证所选克隆中K-ras基因表达缺失，如图3所示。

图1：K-ras敲除方法

图2：亲代细胞和K-ras-/- HCT116细胞sanger测序

图3：K-ras敲除蛋白表达验证

设计并合成gRNA，以靶向GS等位基因上的特定区域。用该载体转染DG44细胞，并通过Sanger测序分析细胞池。
获得了几个单克隆并进行Sanger序列分析。一个单克隆包含移码突变（图1）。
分析GS敲除克隆的GS蛋白表达（图2）。
为了评估功能丧失，在有或没有谷氨酰胺浓度增加的情况下培养GS敲除克隆（图3）。在没有谷氨酰胺的情况下GS敲除克隆不能生长。在增加谷氨酰胺时GS敲除克隆生长，因此确定GS敲除细胞系的功能缺失。
总之，成功靶向GS产生的单克隆已完全验证GS功能的缺失。